不久，李锦、高一功拥众数十万逼常德，腾蛟令堵胤锡接纳，安置在荆州。李锦从此一心跟随腾蛟，农民数十万大军悉归腾蛟节制。后又有明将卢鼎、马进忠、王允成等部亦听命于腾蛟。诸军汇集，号称百万。唐王立拜腾蛟为东阁大学士兼兵部尚书，封定兴伯，总督豫、楚、秦、蜀、粤军务，仍督师。并饬令先收复江西，然后收复南部。何腾蛟指挥农民军约10万余人，驻湖南各地，担负起抗御清兵进攻的重任。在湖广北部的李锦、高一功所带领的18营共30多万人，改名忠贞营，归堵胤锡管辖。何腾蛟把这些农民军略加改编，仍由原来的农民军将领统率，分别驻扎湖广荆襄一带，总号十三镇，即人们所称道的荆襄十三家军。他们不久又和川东各地农民军紧密地联系，发展而为夔东十三家军，在抗请战争中牵制了相当数量的清军兵力。
荆襄十三家军与明军联合后，明军的声势突然强大。1646年春天，清政府派兵进攻湖广，何腾蛟领大军由长沙出发，大败清军于岳州，不久在藤溪、湘阴等地打了几次胜仗，使清军一时不能再向南侵入，隆武政权在福州得以从容立国。
何腾蛟镇守长沙三年，军纪严明，兵将不敢违抗。当时瘟疫流行，他"吊死问孤"、"博施劝谕"，百姓暂时得到复苏。而他自己吃粗粮、野菜，穿补缀的衣服。当时军饷不足，他委任章旷创办义饷，增加地租，预征两年军粮，查抄富户财产，开设铸局铸钱，抽盐税等以资助军饷。难能可贵的是在兵荒马乱中修建文场，开科取士，使两湖之地，不废弦歌，政局得以暂时稳定。
1646年8月，隆武帝及皇后在汀州不幸被清军所俘，死于福州。消息传来，腾蛟大为悲痛，厉兵保境如平时。
当隆武帝殉国的消息传到梧州，广西巡抚瞿式耜等立即返回肇庆拥立桂王朱由榔即位，改年号为永历，拜腾蛟为武英殿大学士，加太子太保。当时，王进才守益阳，闻清军渐逼，退出益阳，还守长沙。这时腾蛟处境十分困难。
1647年2月，清兵逼广东，桂王自肇庆逃到梧州，清军迅速攻下梧州，桂王再奔至桂林。这时，只有大学士瞿式耜坚守桂林，顽强抵抗，桂林才得以保全。当时湖湘一带，总督何腾蛟的部将及率领的荆襄十三家军与清军顽强的战斗起到了前卫作用。
这时，怀有野心的武冈总兵官刘承胤挟持桂王由桂林出走到全州，三月到武冈，由瞿式耜留守桂林。当时汉奸孔有德率领清军大举进攻长沙，马进忠、王进才等纷纷溃退。何腾蛟势孤，单骑走衡州。长沙、湘阴俱失，五月腾蛟至永州，不久，退驻白牙市(今湖南安东县)。
八月十三日，清兵破武冈，刘承胤以城降。桂王携带官眷奔靖州，九月返桂林。而城中只有焦琏一军，腾蛟虑势孤，率赵印选、胡一青入城相助。正危急时，南安侯郝摇旗忽拥众万余至，上下震动。摇旗与焦琏部将角斗，恰逢卢鼎亦带兵至。腾蛟从中调解，使桂林得以安定。于是腾蛟派遣焦琏、郝摇旗、卢鼎、赵印选、胡一青各营分别守兴安、灵川、义宁诸州县，兵势稍振。
十一月，清兵逼全州，腾蛟督五将共同御敌，亲自到营溶江口。次年二月，清军由湖南席卷而下，占领全州、兴安。郝摇旗败走桂林，挟桂王走柳州又奔南宁。三月，腾蛟在永宁闻讯，重返桂林。四月初六，腾蛟督焦琏、胡一青等分三门拒守，腾蛟督诸军鏖战，居中指挥。胡一青率将士，挥戟冲锋陷阵，叱咤撼山岳，清军被击退。腾蛟尾随至岩关，身先士卒，大战于兴安的三里桥。清军列阵塘铺营，漫布山谷，以四股侵入，腾蛟命赵印选率五司将士奋勇当先，多有斩获。直至酉刻，胡一青仍率兵继续战斗，至三里桥，诸将踊跃，无不以一当百，清军再退至兴安。初八日，腾蛟督诸将前至凤凰坪距三里许与清军大战于松林。清军伏兵炮声隆隆。腾蛟令四路出击，命赵印选、胡一青率诸标镇往来冲杀，鏖战良久，望之如在奔雷急电之中。标镇周金汤、熊朝佐奉令从凤凰坪左山横击，清军大败，死者山积，鸾桥之水为之不流。十六日，清军退走。
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